傳說用耶穌在最後的晚餐中用到的聖杯喝水，便能長生不老。在一次掘金活動中，記載聖杯的碑石被發現，聖杯存在的可能吸引著大批的瘋狂的人展開尋找。印第安納瓊斯博士（Harrison Ford飾）也是他們中的一員，甚至連他的父親老瓊斯（Sean Connery飾）也陷入其中——但他給瓊斯留下聖杯的筆記後便不知所蹤。踏上威尼斯的土地，瓊斯和事先約好的史奈達博士（Alison Doody飾）會面，他們在圖書館裡憑線索找到聖盾後，卻開始遭到莫名的來自十字劍兄弟的追殺。一番波折後，瓊斯終於找到了老瓊斯，同時，史奈達的納粹身份暴露，筆記被搶走。聖杯隨時都有可能落入納粹的手中。於是，瓊斯父子倆開始聯袂上演拯救聖杯的精彩大戲！
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